多酚氧化酶(Polyphenoloxidase
多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，果胶PPO)广泛分布于植物细胞内，对多因果蔬内部组织的酚氧暴露而激活，可催化单酚羟基转化为邻二酚或将邻酚氧化成醌，化酶活性而醌类物质极易受到蛋白质或氨基酸的及热亲核攻击生成黑色素，导致果蔬褐变。稳定发生褐变的影响果蔬感官品质急剧下降，营养成分被破坏，果胶难以被消费者接受。对多近年来的酚氧研究发现，高压、化酶活性热、及热脉冲电场及化学抑制剂等处理手段在模型体系中对PP0活性展现出较好的稳定抑制效果。然而，影响与模型体系相比，果胶相同处理手段在食品体系中的钝酶效果具有较大差异，PP0在食品体系中对热和高压钝化的抵抗性普遍强于模型体系。本课题组先前的研究发现梨(cv.Packham)PPO在模型体系(50mm01/L，pH6.0，Mcllvaine缓冲液)中经70℃加热10min后相对活性为16.7％；在梨泥食品体系中经90℃加热10min后，其活性仍高达37.8％同。此外，Dalmadi等发现草莓PP0在模型体系(100mm01/L，pH5.0，PBS)经500～700MPa高压处理15min后活性急剧下降，而Terefe等报道PPO在草莓泥食品体系中经相同条件处理后活性无显著变化。与食品体系相比，模型体系成分相对单一，食品体系中复杂的食品组分可能是这种差异形成的重要原因。
果蔬富含多种营养物质，其中果胶是一类由半乳糖醛酸及其衍生物组成的酸性杂多糖。广泛分布于植物细胞的初生壁和中胶层中，构成果蔬坚硬的质地。果蔬在鲜切、榨汁和制作果蔬泥等加工过程中，由于机械损伤作用果胶可与PPO发生自然接触，同时果胶作为食品添加剂也被广泛应用于果蔬制品。另一方面，在果蔬贮藏及澄清果蔬汁的制作过程中果胶又常被降解或除去，因此果胶是果蔬加工过程中的一个可控制因素。近年来针对食品中生物大分子问相互作用的研究逐渐兴起，其中以蛋白质与多糖二元复合物为典型代表。有研究报道果胶可通过静电相互作用、范德华力以及氢键等非共价作用力与蛋白质结合，从而使蛋白质性质发生改变。因此，果胶作为一种果蔬加工过程中常被添加或去除的物质，它与PPO之问的相互作用很可能影响果蔬制品中PPO活性、稳定性及酶促褐变的发生。研究果胶对PPO活性及稳定性的影响，不仅有助于控制果蔬制品酶促褐变，也为探讨食品组分影响酶促褐变的机理提供理论参考。
本文以蘑菇PPO为主要研究对象，使用紫外分光光度计、荧光分光光度计等考察果胶对PPO酶促反应活性、热钝化动力学、热失活构象变化以及抗坏血酸、柠檬酸、阿魏酸和水杨酸等有机酸抑制PPO活性的影响，以期从食品组分角度解释PP0在模型体系和食品体系中出现稳定性差异的原因，为果蔬实际生产应用及褐变控制方法的选择提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
双孢蘑菇PP0(T3824-250ku，2687U/kg)、橘皮果胶(半乳糖醛酸≥74.0％)，美国Sigma-A1drich公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸，上海西陇科学股份有限公司：水杨酸，天津市永大化学试剂有限公司；抗坏血酸、阿魏酸、左旋多巴(L-DOPA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-1600PC型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；超纯水系统，法国Millipore公司：HH-4型数显恒温水浴锅，江苏省荣华有限公司；F-4500型荧光分光光度计，日本日立仪器有限公司；pH计，上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 果胶-PP0溶液的制备
参考果胶在饮料及鲜果中所占的比重，以50mmol/LpH6.8的磷酸缓冲液为溶剂配制不同质量浓度的果胶溶液和0.35mg/mL的PP0溶液以确保PP0活性在合适范围内，将果胶与PP0等体积混合使果胶质量浓度最终分别为0，O.5，1，2，3，4，5，10和20mg/mL，PP0终质量浓度为0.175mg/mL并置于25℃恒温孵育30min。
1.3.2 PPO活性的测定
PP0活性的测定参照Liu等的方法,将0.1mL混合酶液加入到2.9mL2mm01/LL-DOPA溶液中开启反应，使用紫外-可见分光光度计于25℃监测其在波长475nm处1min内吸光度的变化值，通过斜率可计算PP0氧化L-DOPA的活性,以未添加果胶的PP0样品为空白对照。
1.3.3 热稳定性与热钝化动力学分析
参照Terefe等和周磊等的方法，分别将PP0与不同质量浓度果胶的混合溶液置于45～60℃水浴锅中处理不同时间。以样品中心温度达到既定温度时开始计时,加热结束后立即置于冰水浴中迅速冷却。其钝化过程可用式(1)描述，通过线性回归拟合可得到其钝化动力学曲线。
式中，A0-初始酶活，U；At-时间的相对酶活性，U；k-钝化速率，min-1；t-时间，min。
1.3.4 荧光光谱分析
参考Liu等的方法略作修改。使用F-4500型荧光分光光度计于25℃测定样品的内源荧光光谱，发射与激发狭缝宽均5nm，激发波长280nm，扫描波长范围300～420nm，扫描速度1200nm/min,所有光谱均通过不含PP0的样品光谱作为空白进行修正。
1.3.5 抑制剂对PP0的抑制作用
选用抗坏血酸、柠檬酸、阿魏酸和水杨酸4种常见的有机酸，用浓度分别为0.6，1.2，1.8，2.4mm01/L的抗坏血酸溶液，浓度分别为5，10，15，20mmol/L的柠檬酸溶液，浓度分别为5，7.5，10，12.5mm01/L的阿魏酸溶液和浓度分别为1，4，7，1lmmol/L的水杨酸溶液处理含5mg/mL果胶的PP0溶液，30min后测定其相对活性。
1.4 数据处理与分析
所有试验均重复3次，结果表示为平均值±标准偏差。利用SPSS17.0和Origin8.0软件进行统计分析，显著性水平为0.05。
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